高分辨率熔解曲线(high-resolution melting，HRM)是一种基于单核苷酸熔解温度不同而形成不同形态熔解曲线的基因分析新技术，具有极高的敏感性，可以检测出单个碱基的差异，并且成本低、通量高、速度快、结果准确、不受检测位点的局限，实现了真正的闭管操作。
在突变扫描、单核苷酸多态性分析、甲基化研究、基因分型、序列匹配等方面HRM分析技术发挥着重要作用。
中文名高分辨率熔解曲线
外文名high resolution melting analysis
实质一种基因分析新技术
特点成本低、通量高、速度快等
HRM介绍
高分辨率熔解曲线分析（high resolution melting analysis，HRM）是国际上发展的一种新型的检测单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）及扫描突变的新技术。HRM 无需使用序列特异性探针，而是利用一种饱和染料对 PCR 反应产物进行分析。
基本原理
HRM 的基本原理：双链核苷酸（double strand DNA，dsDNA）的热稳定性受其长度和碱基组成的影响，序列变化会导致升温过程中 dsDNA 解链行为的改变。因为所用的荧光染料只能嵌入并结合到dsDNA 上，因此利用实时 PCR 技术，通过实时检测 dsDNA 熔解过程中荧光信号值的变化，就能以生成不同形状熔解曲线的方式将 PCR 产物中存在的差异直观地展示出来。同时，借助于专业性的分析软件就可以对测试群体实现基于不同形状熔解曲线的基因分型或归类。[1]
技术特点
相对于其它基于 PCR 的 DNA 多态性检测技术如单链构象多态性（single strand conformation polymorphism，SSCP）、变性高效液相色谱（denaturing high-performance liquid chromatography，dHPLC）、变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）等，HRM 的优势在于操作简单，分析时间短，灵敏度和特异性高，PCR 产物无需后处理（如酶切、电泳等），可实现真正的闭管操作从而降低污染风险。另外 HRM 具有高通量的特点，非常适合大量样品的分析。因此HRM 检测方法备受关注，并已发展成为 SNP 基因分型、点突变筛查等的重要手段。
常用仪器
常应用于HRM检测的仪器主要有以下几种：（1）HR-1是美国Idaho 公司生产的第一种专门应用于HRM 的检测仪，主要用于基因预编筛查和SNP分析分型。（2）LightScanner，该仪器荧光采集迅速，温度控制和数据获取优势明显，因此适用于疾病筛查及测序前的大规模突变筛查和基因分型。(3)LightScanner32是Lightcycler PCR仪的功能增强版，其温 度控制及荧光检测的均一性好，可显著降低实验误差。（4）Lightcycler 480是瑞士Roch e公司生产的具有HRM分析功能的板式全自动荧光定量PCR仪，可以做多重PCR检测分析 及多种探针研究模式分析。（5）Rotor-gene6000是全球第一款成功将qPCR扩增与HRM结合 在一起实现闭管操作的仪器。
应用
SNP分析不同个体同一条染色体上同一位点的核苷酸序列绝大多数是一致的，当单个核苷酸碱基不同而导致核酸序列呈包括置换、缺失和插入等多态性时，称单核苷酸多态性，即SNP。SNP现象在生物体内广泛存在，它是生物遗传变异的表现之一，因而SNP对研究人类遗传和进化具有重要意义。
突变扫描运用HRM技术可以进行样本中已知突变位点的检测、未知新突变位点的鉴定，已知多态位点(如SNPs、短串联重复序列、微卫星、条形码序列等)的检测等。HRM技术已经在人类和动植物遗传疾病的分子诊断、动植物各类多态位点的鉴定与检测、动物生产繁殖数量性状位点的鉴定与检测等研究领域获得了应用，并取得了很多新的研究进展。
甲基化研究DNA 甲基化是发生在DNA碱基序列上的一种共价修饰。靶序列上甲基基团的存在可以影响转录因子的结合，引起转录抑制，从而使该基因的表达受到抑制。DNA甲基化是表型遗传修饰的重要组成部分，在细胞正常功能维持、遗传印记、胚胎发育和肿瘤发生中扮演重要角色。HRM技术为DNA甲基化状态的检测另辟蹊径。DNA样品通过亚硫酸氢盐的处理，将未甲基化的胞嘧啶转化成尿嘧啶。这样，原先未甲基化模板所产生的PCR产物比甲基化模板的Tm要低。HRM还能确定特定样品中甲基化的比例。将不同比例的甲基化和未甲基化DNA混合，制作出标准曲线，将样品的熔解曲线与之相比较，从而确定样品中甲基化的比例。
基因分型HRM技术使用了饱和荧光染料和改进的熔解及分析系统，可检测核酸间的微小差异，其最先被应用于基因的分型试验。运用该技术进行基因分型较传统的分型方法（凝胶电泳，高效液相色谱等）具有显著的优越性，并取得了很多新的研究进展。人β球蛋白的HbC，HbS和HbE 3个基因型在113bp区域中，运用以往的技术很难将它们区分开，Herrmann等应用HRM技术将β球蛋白的3个基因型分别检测出来。曹春鸽[2]利用HRM技术，快速灵敏地对64例随机DNA样本的CYP2C 19*2和CYP2C 19*3 两个多态性位点进行了基因分型，且HRM方法的分型结果与测序验证结果完全一致。
序列匹配有些研究并不需要完全的基因型，而只需知道 DNA 序列是否匹配，例如：组织移植、基因型-表型的相关性和辩证性. 在活器官移植中，需要对 HLA 进行基因分型. 这个主要牵涉到HLA-A，B，C 和 DR 等几个位点. 当两个个体的熔解曲线完全相同时就说明 HLA 基因型完全匹配. 通过 1∶1 混合样品进行熔解曲线分析，如果样品不是完全匹配的，那么就将形成不同杂合子而改变溶解曲线，由此可以通过这种方法来验证试验结果。
定量研究HRM技术具有高度的灵敏性，能鉴别熔解曲线的微小变化，因此可以用做定量分析。检测变异分子所占的比例，通常使用的方法为双脱氧测序法和（分辨率下限为20%-30%）和焦磷酸测序法（分辨率下限为1%-10%），但这2种方法既费时又费力。Aten等（2008）和Bruder等（2008）成功地运用HRM技术进行了不同等位基因的 定 量 分 析，结果表明HRM技术可以达到12.5%的分辨率。
对凝胶电泳的替代PCR反应和酶切反应结果的检验方法是传统的琼脂糖凝胶电泳，但这种方法要结合一些有毒染料（如溴化已锭（EB））进行染色，对试验人员的安全产生潜在的威胁。HRM技术替代琼脂糖凝胶电泳是一种很好的选择，通过熔解曲线可以清楚地鉴别反应产物的特异性和浓度大小等。其优点非常明显，不必使用凝胶基质和有毒染料，后期的数据处理也可以通过分析软件自动进行，可以加快试验的速度（核酸熔解的速度远远大于琼脂糖凝胶电泳的速度），且HRM技术不会损害所分析的核酸样品，仍然可以做凝胶琼脂糖电泳检测。[3]
技术展望
HRM技术具有高通量、高灵敏度和特异性、操作简单灵活、成本低、对DNA分子无损害、闭管操作等诸多优点。在人类疾病的诊断方面，HRM技术必将从试验研究走向临床诊断，成为人类分子疾病临床诊断的新手段。HRM技术具有广泛的应用前景，尤其是在临床诊断方面具有相当巨大的发展空间，将会广泛应用于动植物基因检测、食品安全、考古等诸多其他领域。
参考资料1.利用高分辨率熔解曲线(HRM)分析梨微卫星标记 · 知网空间（引用日期：2014-07-25）
2.应用HRM技术对CYP2C19*2 和CYP2C19*3 进行双重SNP分型 · 万方数据（引用日期：2014-07-25）
3.高分辨率熔解曲线分析应用的研究进展 · 知网空间（引用日期：2014-07-25）
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